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      人高遷移率族蛋白1(HMGB-1) ELISA測定試劑盒操作方法及原理

      更新時間:2023-07-19   點擊次數:391次

      人高遷移率族蛋白1(HMGB-1) ELISA測定試劑盒操作方法及原理

      實驗原理:

      試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被人高遷移率族蛋白1(HMGB-1)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人高遷移率族蛋白1(HMGB-1)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。


      樣本處理及要求:

      1.  血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

      2.  血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

      3.  組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

      4.  細胞培養物上清或其它生物標本:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

      注:標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。


      需要而未提供的試劑和器材:

      1. 酶標儀(450nm)

      2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

      3. 37℃恒溫箱

      4. 蒸餾水或去離子水




      試劑盒組成:


      名稱

      96孔配置

      48孔配置

      備注

      微孔酶標板

      12孔×8條

      12孔×4條

      標準品

      0.3mL*6管

      0.3mL*6管

      樣本稀釋液

      6mL

      3mL

      檢測抗體-HRP

      10mL

      5mL

      20×洗滌緩沖液

      25mL

      15mL

      按說明書進行稀釋

      底物A

      6mL

      3mL

      底物B

      6mL

      3mL

      終止液

      6mL

      3mL

      封板膜

      2張

      2張

      說明書

      1份

      1份

      自封袋

      1個

      1個

      備注:

      1.  標準品濃度依次為:向客服索取

      2.  經過大量正常標本檢驗,標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內,實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時,可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。


      注意事項:

      1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

      2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

      3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

      4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

      5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

      6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

      7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

      8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

      9. 不能使用過期產品。

      10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。




      試劑準備:

      試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

      20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。


      操作步驟:

      1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

      2.  設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

      3.  樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。

      4.  除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

      5.  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

      6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

      7.  每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。


      實驗結果:


      以所測標準品的OD值為橫坐標,標準品的濃度值為縱坐標,在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計算出樣品的濃度。

      (此圖僅供參考)





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